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動物體內實驗常見問題

Q:不經過化學修飾的siRNA可否用于動物實驗?

A:采用專門的轉染試劑或特殊的給藥方法,不經修飾的siRNA也可用于動物實驗,但是動物實驗對siRNA試劑在體內的穩定性和半衰期有較高的要求,通常推薦經特殊化學修飾或In vivo級別的試劑,以提高其穩定性和半衰期。

Q:選用哪一類化學修飾可以用于siRNA in vivo實驗?

A:銳博生物提供多種化學修飾方式,常用的有2’OMe,FU/FC,PS等,您可以自行選擇修飾方案,此外我們還提供動物實驗專用的siRNA。

Q:修飾的siRNA在細胞水平的實驗已經完成,是否可以用余下的siRNA做動物實驗?

A:一般不建議用余下的siRNA試劑,因為動物實驗體內條件更加復雜,一般需要采用專門的處理標準來合成siRNA,故應購買更可靠的動物實驗專用siRNA。

Q:動物實驗用的siRNA有Standard, in vivo;PAGE, in vivo;HPLC, in vivo,三者有什么區別,該如何選擇?

A:三者均按照動物實驗siRNA標準來處理或純化,均可以用于動物體內實驗。區別在于其純度不同:Standard即全長RNA含量不低于80%;PAGE和HPLC即全長RNA含量不低于95%。試劑純度越高,特異性和靶向性會更好,作用效果更加可靠,但成本也會更高。因此,如經費允許且要求高的條件下,建議選擇更高純度的siRNA進行實驗。

Q:使用銳博生物動物實驗用siRNA有發表過文章嗎?是否可以提供參考?

A:有,請聯系我司業務代表

Q:針對不同的器官如何給藥?給藥的推薦量是多大?給藥頻率是多少?

A:給藥方法大致分為系統給藥(如靜脈給藥、腹腔給藥等)和局部給藥(如皮下注射,玻璃體給藥,鞘內給藥等),一般需要根據不同的器官來選擇,給藥量也視不同的對象而異,主要是體重情況,如肝臟、腎臟常用靜脈注射(系統給藥);而皮下腫瘤則常用到瘤內注射(局部給藥);系統給藥每次注射5~20nmol/20g體重,局部給藥則需每次注射1~5nmol/20g體重,給藥頻率往往是一周2~3次。

Q:進行小鼠的體內研究需要多少量的siRNA?

A:首先需要根據動物模型和實驗方案,確定給藥量和給藥次數,然后計算出實驗所需的總用量。系統給藥每次注射5~20nmol/20g體重,局部給藥則需每次注射1~5nmol/20g體重,給藥頻率往往是一周2~3次。

Q:miRNA agomir/antagomir針對不同的器官如何給藥?給藥的推薦量是多大?給藥頻率是多少?

A:給藥方法大致分為系統給藥(如靜脈給藥、腹腔給藥等)和局部給藥(如皮下注射,玻璃體給藥,鞘內給藥等)。給藥方法的選擇需要根據不同的器官來選擇,而給藥量因不同的給藥量而異。如肝臟、腎臟常用靜脈注射(系統給藥);而皮下腫瘤則常用到瘤內注射(局部給藥)。系統給藥: agomir每次注射5~20nmol/20g體重, antagomir每次注射50~200nmol/20g體重;局部給藥: agomir每次注射1~5nmol,antagomir每次注射5-20nmol。給藥頻率往往是一周2~3次。

細胞轉染實驗常見問題

Q:miRNA agomir/antagomir針對不同的器官如何給藥?給藥的推薦量是多大?給藥頻率是多少?

A:給藥方法大致分為系統給藥(如靜脈給藥、腹腔給藥等)和局部給藥(如皮下注射,玻璃體給藥,鞘內給藥等)。給藥方法的選擇需要根據不同的器官來選擇,而給藥量因不同的給藥量而異。如肝臟、腎臟常用靜脈注射(系統給藥);而皮下腫瘤則常用到瘤內注射(局部給藥)。系統給藥: agomir每次注射5~20nmol/20g體重, antagomir每次注射50~200nmol/20g體重;局部給藥: agomir每次注射1~5nmol,antagomir每次注射5-20nmol。給藥頻率往往是一周2~3次。

Q:如何選擇轉染方法和轉染試劑?

A:轉染方法和轉染試劑的選擇要根據不同細胞來選擇,對于容易轉染的細胞可以選擇riboFECT CP轉染試劑,對于mRNA/長鏈RNA轉染、原代細胞或難轉染的細胞,可以選擇riboFECT mRNA轉染試劑,對于高效的蛋白轉染,可以選擇riboFECT Protein轉染試劑。 銳博生物提供從siRNA/miRNA、mRNA/長鏈RNA到蛋白質的全系列轉染試劑,請根據下表確定適合您的轉染試劑

siRNA/miRNA/質粒轉染試劑,基因抑制效率高 mRNA/長鏈RNA轉染試劑,適用于原代細胞 蛋白質轉染試劑,可實現最高效轉染
riboFECT? CP轉染試劑 riboFECT? mRNA轉染試劑 riboFECT? Protein轉染試劑
試劑規格 0.5ml, 1ml 0.5ml, 2.5ml 0.5ml, 2.5ml
樣品類型 siRNA, miRNA mRNA, 長鏈RNA 蛋白質
轉染效率 極佳 極佳 最高,可高達98%
細胞活力 極佳 極佳
細胞毒性 極佳 超低 幾乎無細胞毒性
轉染細胞系(部分) HeLa,A549,HEK293T,HCT-116,NIH/3T3,HepG2,HNE1,L6,5637,H-bc,HSC,C2C12,Sertoli,CNE-2,5-8F,HAEC,DRG,CF,THP-1,MEL,PBMC,NSC,MSC,U2OS human fibroblasts,CHO-K1,B16-F10,HEK293 HEK293,B16-F10,COS-7,COLO 205,dendritic cells (DC),H9c2,human fibroblasts (primary cells),HUVEC (primary cells),Jurkat,MC3T3-E1,MEF (primary cells),microglia,mouse podocytes (primary cells),NIH/3T3,SK-OV-3,U-373 MG
Q:對于難轉染的細胞,應該如何提高其轉染效率?轉染效率又該如何確定?

A:1.對于貼壁細胞,推薦采用轉染試劑轉染即可; 2.對于難轉染的細胞的轉染,一般建議使用電轉的方法,但是由于電轉的方法對細胞損傷比較大,該方法也未必是最佳的,可以選用riboFECT mRNA轉染試劑。 常采用熒光標記siRNA在熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡或流式細胞儀檢測轉染效率,具體請參產品說明書。

Q:細胞的轉染效率是否與siRNA序列相關?

A:轉染效率高低取決于細胞自身及轉染方法,與siRNA序列無直接的關系。

Q:轉染siRNA時細胞密度多少為宜?

A:依不同的轉染方法或轉染試劑而定。如使用riboFECT? CP Reagent轉染siRNA,細胞密度達到50%~80%最佳。

Q:轉染時的培養基要求,可否含血清?

A:不同的轉染試劑要求可能不同,對于riboFECT? CP Reagent,在配制siRNA和riboFECT? CP混合物時不能含有血清,但細胞培養基可以含有血清,但不能含有抗生素。

Q:siRNA儲存液體濃度和工作濃度有何區別?

A:siRNA的貯存濃度就是保存的最佳濃度,銳博推薦的貯存液濃度為20 μM;而siRNA的工作濃度是使siRNA能夠達到最佳沉默效果的轉染濃度,一般10~100 nM范圍內,銳博生物推薦的轉染濃度是50nM。

Q:轉染時該如何分組?分組的目的是什么?

A:

A組(必需)針對目的基因siRNA(重復三個孔)knockdown目的基因的表達
B組(必需)陰性對照siRNA(重復三個孔)用非特異的siRNA序列證明RNAi作用的序列特異性
C組(必需)轉染試劑對照(重復三個孔)排除轉染試劑對細胞的毒性或對目的基因表達的影響
D組(必需)空白對照(重復三個孔)用于檢測實驗過程中細胞的生長狀態
E組(可選)陽性對照siRNA(重復三個孔)用于排除實驗體系和實驗操作的問題
F組(可選)熒光對照siRNA(重復三個孔)用于轉染效率。當不明確細胞轉染效率時,這一組為必需。

Q:用熒光對照siRNA如何檢測轉染效率?是不是每次實驗都必須做?

A:我們提供的轉染對照siRNA帶有Cy3或Cy5熒光標記,可以通過熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡、流式細胞儀等熒光檢測儀器檢測。除此之外,還應該通過陽性對照實驗進一步確定。轉染效率的高低主要與細胞自身相關,同等實驗條件下,每次轉染效率應該是相近的,因此不必每次都做。但如果每次實驗都做一個熒光對照組,將會更有利于排除一些實驗問題。

Q:轉染后出現細胞死亡是什么原因?如何優化轉染條件?

A:如果是轉染試劑對細胞的毒性,則可以減少轉染試劑用量,或換用其他轉染試劑或轉染方法;如果細胞自身狀態不好,則建議重新實驗,必要時重新復蘇細胞。

Q:到了轉染時間發現細胞密度太低,該如時轉染,還是讓細胞多長一天再轉染?

A:細胞生長需要一定的密度,而轉染試劑對細胞有一定的毒性,如果轉染時細胞密度過低,細胞可能會因此生長異常甚至死亡。轉染前要求良好的細胞狀態和細胞活性,一般也不建議用生長幾天的細胞做轉染。

陽性對照和陰性對照實驗常見問題

Q:為什么說陽性對照在RNA干擾實驗中很重要?

A:陽性對照作為一個實驗系統檢查是很重要的。也就是說,當您看到siRNA陽性對照的預期實驗結果時,可確保您的實驗方法中轉染、RNA提取物和檢測方法是可靠的。

Q:陽性對照及其陰性對照在RNAi實驗中的作用?如何選擇?

A:陽性對照指的是已經驗證的針對看家基因或報告基因有效的siRNA,用于監測實驗體系和實驗方法的可行性。銳博生物提供針對GAPDH,ACTB,GFP/EGFP有效的siRNA作為陽性對照,您可以根據具體的實驗需要選擇。陰性對照往往是非特異的siRNA,主要用于說明siRNA作用的特異性,可以根據實驗需要選擇通用的序列(universal)或是隨機打亂的序列(scramble)。

Q:各組陰性對照的檢測結果是否應該一樣?如果偏差很大該怎么辦?

A:正常情況下,各組陰性對照的檢測結果應該是相近的。如果偏差過大,只需考慮實驗結果的準確性。另外,對于一些特定的基因,比如與細胞難受壓力相關的基因,又如參與細胞免疫的基因,可能會對外界壓力比較敏感,使得各組對照的基因表達發生變化不一致。

RNAi實驗常見問題

Q:siRNA熒光染料的最大吸收率和發射率各在哪個波段?

A:FAM在495nm處有最大吸收率,在520nm處有最大發射率。 Cy3在550nm處有最大吸收率,在565nm處有最大發射率。 Cy5在643nm處有最大吸收率,在667nm處有最大發射率。

Q:siRNA作用效果應該如何檢測?

A:通常可以從三個方面來相互驗證siRNA的作用效果 1) 用Realtime RT-PCR方法,從mRNA水平檢測: 2) 用Western blot,ELISA等方法,從蛋白水平檢測; 3)用高內涵顯微鏡,根據目的基因的功能,從細胞表型水平檢測。

Q:siRNA在細胞內可以作用多長時間?什么時候才是最好的檢測時間?

A:siRNA介導的RNAi屬于瞬時現象,不能穩定傳代,一般其作用時間不可能維持很長時間,通常建議在轉染后3~4天內完成檢測。最佳檢測時間,因細胞、目的基因而異,多在轉染后24~48小時之間檢測。

Q:為什么要強調mRNA水平檢測?可以直接檢測蛋白和功能嗎?

A:siRNA直接作用于mRNA,因此mRNA水平檢測是最直接在指標。 很多客戶認為,mRNA降解的直接結果應該是對應蛋白質含量的下降,因此蛋白水平的檢測結果也應該可以作為有效性的檢測指標。事實上,很多情況下會出現mRNA下降水平與蛋白下降水平不對應的現象。其可能原因有: 1) 與選擇的檢測時間有關。可能因mRNA的下降尚未反映在蛋白量的變化上或者未達到足以檢測的水平,所以一般建議蛋白和功能檢測時間要稍稍推后。 2) 與蛋白在細胞中的表達情況有關。mRNA的翻譯過程非常復雜,細胞內基因的表達總要維持一個平衡,某些蛋白表達量到一定的程度之后,足以維持其細胞功能,將可能暫時“關閉”表達的功能,轉錄出來的部分mRNA可能不參與蛋白翻譯的過程,故mRNA水平下調與蛋白水平下調并非完全成正相關的關系。 3) 可能還會涉及到更加復雜的機制。

Q:干擾效率多高才是好的靶點?

A:沒有明確的界定,干擾效率高低因不同的細胞類型和不同的基因而異。不同細胞類型的轉染效率也不盡相同,不同基因的表達水平也相差較大,主要看干擾效果而定。

Q:沉默效果不理想,應該如何處理?

A:最常見的影響沉默效果的兩個原因:轉染效率低和siRNA序列設計的效果不理想。如果您初次使用siRNA或采用了新的細胞系,并發現沉默效果不佳,我們建議您對轉染效率進行檢測,并選擇優化轉染條件。如果您已經對實驗轉染條件進行優化但是問題依然存在,我們建議您換用另一種轉染試劑或是采用其他技術,這也許能提高轉染效率。如果已經提高了轉染效率但是沉默效果仍然未達到要求,可能是因為siRNA序列設計的效果不理想。

Q:siRNA使得目的基因表達上調了,這是什么原因?該怎么解決?

A:可能的原因: 1.由于轉染濃度過高或轉染條件不合適,導致基因表達異常,可嘗試優化轉染條件; 2.與細胞類型相關,可能某些細胞對外界刺激比較敏感,可嘗試換用其他細胞; 3.檢測結果不準確,優化檢測條件(RNA質量、引物設計、反應條件等)

Q:我從陰性對照實驗中得到和特異性RNAi相同的結果,這說明了什么?

A:可能的原因: 1.非特異性作用的結果:由于轉染濃度過高或轉染條件不合適,導致基因表達異常,可嘗試優化轉染條件; 2.所選用的陰性對照siRNA序列發生了不預期的off-target作用,對目的基因也發生干擾作用,嘗試換用其他的陰性對照siRNA。

Q:用100nM 的siRNA轉染時只得到50%沉默效率,可否把siRNA的濃度增加到200nM甚至400nM?

A:當干擾效率不佳時,可以在一定范圍內適當優化轉染濃度,通常優化的范圍是10~150nM,但不宜過大,高濃度的siRNA將可能增加非特異性作用的可能性并對細胞產生毒性。

Q:同樣的siRNA,為什么在細胞A很有效,在細胞B則沒有效果?

A:不同細胞的轉染效率不一樣、基因表達水平也不一樣,這些都與siRNA的作用效率有關。

Q:siRNA該如何設計?

A:我們有自主開發的在線的設計軟件siCatchTM siRNA design tool。客戶提供基因名稱或基因ID,銳博生物可以提供免費設計的服務。

Q:siRNA的末端懸垂是必須的嗎?該如何選擇?

A:傳統的siRNA結構是19 mer + 2’懸垂的結構,目前也有一些siRNA是頓末端的。懸垂的選擇上,dTdT/UU是最常見的,另外也有以dNdN(N代表與基因序列對應的堿基)作為懸垂的。懸垂的選擇對于siRNA的作用效率并沒有很大影響。

Q:如果知道某一基因產物的蛋白序列,可以設計一條靶向這個蛋白的siRNA嗎?

A:siRNA的作用是在RNA水平,而不是在蛋白質水平。要設計siRNA,必須準確知道靶mRNA序列。由于遺傳密碼的兼并性和密碼子的偏移,不可能通過蛋白序列準確預測核苷酸序列。轉錄后的RNA前體通過剪接去除內含子序列形成成熟的mRNA。因為siRNA的功能是酶解mRNA序列的,根據基因組序列設計的RNA序列有可能落在內含子區,導致設計的siRNA無效,所以應該根據mRNA序列而不是基因組序列來設計siRNA。

Q:為什么在已公布的siRNA序列中5’端部分有AA結構?這一結構是否是必須的?

A:過去“AA”代表siRNA靶序列的起始端,研究者常將它們作為序列組成的一部分,但它們卻不是作為合成siRNA序列的一部分。siRNA靶序列往往寫成“AA-(N19)”的格式,其中“AA”用于提示3’端懸垂為dTdT 或UU。N19靶序列和兩個懸垂組合形成一個21-mer的雙鏈。這一結構并不是siRNA設計的必需要求。

Q:針對人體基因設計的siRNA對其他物種是否也有效?

A:盡管不同物種的基因是同源基因,但是這些同源基因的表達序列都存在或多或少的差別,而siRNA要求序列特異性,即完全互補配對,故大部分siRNA無法滿足多物種基因沉默的效果。即便是針對不同物種的同源基因的相同片段,由于基因表達差異,也不能保證其在不同物種中的基因沉默效果。

Q:siRNA是否可以做修飾或標記,該如何選擇?

A:可以對siRNA做修飾或標記,我們可供選擇的修飾或標記見化學修飾siRNA部分。為避免修飾或標記后對siRNA作用效率的影響,修飾或標記多選擇在正義鏈(需根據具體的實驗要求而定)。

Q:化學合成的siRNA靶點序列是否可以用于構建shRNA真核表達質粒載體?

A:可以,但不同shRNA表達載體對序列還有特定的要求,因此必須考慮表達載體的具體要求來確定可行性。

Q:化學合成方法篩選出有效的序列構建到shRNA表達載體之后是否會同樣有效?

A:理應有效,但由于載體表達相對比較復雜,其有效性涉及到載體是否能否在細胞內強表達、是否可以被正確加工等問題,因此不排除出現shRNA不工作的情況。

Q:shRNA表達載體的方法有效的序列用化學合成的方法來做是否會同樣有效?

A:shRNA表達載體的方法容易出現“假陽性”,不排除出現siRNA不工作的情況。

Q:siRNA是否需要低溫運輸?

A:我們的siRNA以凍干粉的形式供貨,可以在常溫下運輸。收到產品后應在-20~-80℃條件下保存。

Q:shRNA表達載體的方法有效的序列用化學合成的方法來做是否會同樣有效?

A:shRNA表達載體的方法容易出現“假陽性”,不排除出現siRNA不工作的情況。

Q:由于快遞的原因將近一周才收到siRNA,室溫條件下放置這樣長時間,siRNA會降解嗎?

A:凍干粉形式的siRNA在常溫下可以穩定存在1-2周。

Q:shRNA表達載體的方法有效的序列用化學合成的方法來做是否會同樣有效?

A:shRNA表達載體的方法容易出現“假陽性”,不排除出現siRNA不工作的情況。

Q:siRNA應該如何溶解,如何保存?

A:開蓋之前請短暫離心,加入滅菌的RNase-free H2O或者滅菌的ddH2O,配制成20μM貯存液,適當分裝并于-20℃-80℃條件下保存。

Q:我需要配置濃度為20uM的儲存液,如何計算重懸siRNA緩沖液的量?

A:銳博生物為您提供的siRNA是以nmol為單位的凍干粉。樣品濃度的計算如下:(siRNA的量,nmol)/(重懸體積,uL)=樣品濃度,umol/L。例如:您購買了5nmol的siRNA,想溶解為20uM的樣品,應該使用250uL緩沖液溶解,配置為20uM的樣品。具體的溶解體積可以參見下表: 表1 20μM儲存液的配置參考

siRNA(nmol)0.250.512520
溶解體積(μl)12.525501002501000

Q:siRNA溶解后保存在-20℃,反復使用多次,會影響siRNA的質量?

A:我們建議溶解后分裝保存,一般不建議溶液形式的siRNA反復凍融超過5次。

Q:siRNA使用前是否需要先退火?

A:我們的siRNA已經完成退火,可以直接使用。

Q:轉染miRNA mimic和inhibitor如何確定轉染率?

A:最直接的方法為加設轉染對照,直接觀察轉染率。

Q:miRNA mimic和inhibitor轉染時的濃度是否一樣?

A:由于miRNA inhibitor其競爭抑制性的作用機制,其往往需要較大的用量才能觀察到預期的抑制效果,則相當于mimic的幾倍用量。推薦的mimics轉染濃度為50nM,inhibitor轉染濃度為100nM。

Q:多個miRNA的共轉染怎么做?

A:根據每個miRNA的轉染濃度取量,按照常規的方法轉染即可。

Q:miRNA mimic實驗結果不能重復?

A:可能與miRNA表達及作用的時空特異性相關

Q:miRNA inhibitor及其miRNA antagomir的區別是什么?該如何選擇?

A:miRNA inhibitor和antagomir都用于抑制miRNA的功能研究,二者的區別也主要在修飾方式上。細胞實驗可以二者選擇其一,而動物實驗選擇antagomir相對比較有優勢。

qPCR實驗常見問題

Q:miRNA qPCR實驗的重復如何設置?

A:重復分為兩類,一類是生物重復,一類是技術重復,生物重復是從處理樣本后重新提取RNA開始,是幾次完全獨立的實驗;技術重復可以在cDNA合成或者PCR反應的兩個過程任選一步進行重復,主要看實驗操作過程有無問題,一般選擇在PCR時重復3次。

Q:5S qRT-PCR的產物有多大?

A:91bp,人、小鼠、大鼠的5S是同源的。

Q:U6 qRT-PCR的產物有多大?

A:94bp,人、小鼠、大鼠的U6是同源的。

Q:Bulge-Loop? miRNA qRT-PCR的產物有多大?

A:80bp左右,不同miRNA的qRT-PCR的產物長度不盡相同,具體長度要依據實際引物長度而定。

Q:NTC 有擴增 ?

A:可能原因: 1) 試劑污染;2) 引物二聚體 解決辦法: 1) 更換試劑;2) 降低引物使用濃度 ;3) 調整程序設置,如提高退火溫度,適當增加讀板溫度

Q:非特異性擴增有雜峰?

A:可能原因: 1) RNA被基因組DNA污染 2) 引物混雜有其他引物 3) 引物二聚體存在 解決辦法: 1) 提取更高質量的RNA,并用DNaseI處理樣本 2) 在冰上配制反應體系,降低非特異的起始擴增 3) 調整反應體系,如降低引物使用濃度,降低起始模板量 4) 調整程序設置,如提高退火溫度,適當增加讀板溫度 5) 更換被污染的RNA模板、引物、酶等試劑

Q:qPCR產物量少該如何解決?

A:可能的原因: 1) RNA模板質量低或者cDNA模板質量低 2) 靶miRNA基因表達量低或者無表達,無法檢測 3) 試劑中存在PCR抑制劑 4) PCR儀是否正常運轉 5) PCR程序設置有無問題,如:循環數不夠、無讀板過程、無制作融解曲線的過程等 6) PCR過程所用試劑少加一種或多種,如,sybr、正反向引物、模板 7) PCR過程所用的酶、sybr等試劑有無失效等問題 8) 定量PCR引物的問題:如使用濃度太低、引物設計不好、引物合成序列有誤等 解決辦法: 1) 建議在試驗中加入陽性對照RNA 2) 增加RNA和/或cDNA模板的量 3) 保證定量PCR儀運轉正常 4) 調整程序設置,如增加循環次數,正常讀板過程和溶解曲線制作過程 5) PCR反應所使用的酶一般為熱啟動聚合酶,預熱過程需根據酶說明書設置 6) 保證PCR反應體系配制過程中無少加或漏加試劑,并且試劑均有效 7) 第一鏈的反應產物在進行PCR擴增時,在總的反應體系中的含量不要超過1/10

Q:cDNA產量低該如何解決?

A:可能的原因: 1) RNA模板質量低 2) 對mRNA濃度估計過高或濃度未測準確 3) 反應體系中存在反轉錄酶抑制劑或反轉錄酶量不足 4) 反應體系少加試劑 5) 控溫過程不正確,高溫使反轉錄酶失效,低溫達不到反轉錄酶的最佳反應效率 6) 反應體積過大,導致試劑被稀釋 解決辦法: 1) 重新提取高質量的RNA模板,并準確測定其濃度 2) 保證加入各種試劑建立完整的反應體系 3) 保證控溫過程正確 4) 反轉錄反應體系不要超過50uL

Q:擴增曲線先正常上升,后來卻下降,溶解曲線不規則,原因何在?

A:反應體系中存在酶抑制劑或者其他原因導致PCR酶失活或者染料降解,建議重提RNA模板,更換PCR試劑重新實驗。

Q:轉染了mimics或inhibitor后,可否用qPCR引物檢測轉染后miRNA量的變化,注意的問題有哪些?

A:我們的實驗發現,對于轉染效率比較高的細胞(如hela,A549等) ,一般轉染mimics 50nM后與no-target相比高出約1萬倍,轉染表達miRNA的質粒后與空白對照質粒相比高出幾百倍,inhibitor理論上與miRNA結合后阻止其與靶mRNA的結合,inhibitor并未導致miRNA的降解,因此qPCR可以檢測mimics轉染后miRNA表達的上升,無法檢測inhibitor轉染后miRNA表達的下降,當然如果某些inhibitor確實通過未知途徑導致miRNA的降解也可檢測到miRNA表達的下降。 RNA提取及RT-PCR過程無特殊注意事項,只是轉染過程注意保證轉染效率。

Q:內參與miRNA的反轉錄反應應該分管進行還是同一管進行?原因何在?

A:內參的設置主要是為了校正上樣量的差異,保證基因在同一起跑線上比較。如果能保證加樣量一致,兩種方法沒有實質區別。一般基因mRNA檢測時一個反轉錄就可以檢測所有mRNA基因,因此反轉錄是在同一管進行。由于miRNA自身短小的特點,每個miRNA均需用特異的反轉錄引物進行反轉錄,這些反轉錄引物如果不能混在一起,則內參的反轉錄也分開進行。

Q:不同的miRNA反轉錄引物可以混合使用嗎?

A:引物之間的混合有可能導致引物二聚體的產生及非特異的擴增,因此引物混合前要做預實驗比較混合前后對miRNA定量檢測的影響,如果證明混合后沒有影響才能混合使用,建議每個miRNA還是分開反轉錄和定量PCR。

Q:不同miRNA的溶解曲線峰值有差異,同一miRNA引物擴增不同RNA模板的溶解曲線峰值有差異?

A:溶解曲線只有用染料做檢測時才有,用Taqman探針等則無溶解曲線繪制過程。溶解曲線的繪制原理是內嵌染料結合在體系中所有雙鏈DNA上(dsDNA),包括目標產物、非特異擴增產物、引物二聚體等,隨著溫度從低于產物溶解點緩慢上升到高于產物溶解點,產物逐漸解鏈,內嵌染料釋出,實時儀器連續監測樣本的熒光值逐漸降低,并在產物溶解點處熒光值下降最快,反應在溶解曲線上就是一個峰值;產物完全解鏈后,儀器監測的熒光值達到平臺期。擴增產物的長度、G/C含量、pH值、離子濃度、蛋白殘留物等均會影響峰值。對于同一引物擴增不同模板,一般認為峰值相差±1℃時可以忽略不計,否則考慮引物、模板等有問題,需更新重做實驗。對于不同引物,若為單峰,則不必考慮峰值差別的影響。

Q:實驗所用的酶和其他試劑是否有特殊要求?

A:引物對于酶、其他試劑、儀器等沒有特殊的要求,唯一的要求是在相同的條件下進行實驗,如用相同的儀器,相同的試劑,相同的程序等。不同廠家的試劑、同一廠家不同批次的試劑、不同的儀器等做出來的結果在擴增曲線,及溶解曲線可能會稍有差異,但這對于相對定量沒有影響。 對于不同廠家的試劑或者不同的儀器,建議做一個預實驗先摸索我們推薦的反應體系及程序是否可用,如果結果不理想,可根據試劑說明、儀器參數設置原則等做適當調整。

Q:PCR擴增效率低?

A:理論上說,PCR擴增效率接近100%是最理想的擴增效率,但實際操作時,反應的擴增效率應該在90%-110%之間,擴增效率的計算公式為:擴增效率E=10-1/斜率-1,其中斜率為標準曲線的斜率,其范圍應該在:-3.1至-3.5。如果擴增效率低,可能的原因是PCR反應中存在PCR酶抑制劑、PCR染料失效、引物設計不當、反應條件未優化等;擴增效率大于100%時,可能的原因是系列稀釋樣品時的計算或者加樣錯誤、有非特異擴增產物、或者有引物二聚體產生等。

Q:PCR過程設置的對照及反應的問題?

A:陽性對照:一般用RNA反轉錄的cDNA做模板,檢測看家基因,如β-Actin、GAPDH等。目的是檢測反轉錄及PCR過程中反應體系配置、儀器等參數的設置及操作過程有無問題。或者用用質粒做模板,定量PCR定量擴增克隆產物,檢測PCR反應體系及操作過程的有無問題。 陰性對照:用水做做模板陰性對照,檢測反應體系所用試劑有無污染。用RNA做模板陰性對照,檢測抽提RNA過程有無DNA污染。 內參檢測:可檢測β-Actin、GAPDH等看家基因的表達,以作內參。

Q:對于Bulge-Loop,qRT-PCR Primer中RT反應有沒有特殊要求?

A:并無特殊要求,普通的試劑盒即可進行RT反應,實驗時將試劑盒的RT primer 換成Bulge-Loop? RT primer即可。具體的實驗信息參閱所使用的RT試劑的操作說明。

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