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銳博生物自主開發的riboEDIT? CRISPR-Cas9體系是采用天然復合物系統(crRNA和tracrRNA)進行基因編輯。 銳博提供基于Cas9 mRNA的全RNA體系和基于Cas9蛋白的RNP體系,tracrRNA可實現大規模合成,靶向DNA目的序列的crRNA可以高通量合成,針對哺乳動物細胞可簡單通過化學轉染或電轉方式進行基因編輯實驗。該體系為即用型體系,不需要自行構建gRNA表達載體,無需在病毒級實驗室中操作,無DNA組分,并且可實現多個crRNA指導下的多靶點編輯,大大簡化前期實驗準備與操作步驟。該體系更適合于高通量細胞水平的基因敲除篩選。銳博生物還提供業界領先的編輯效率保證CRISPR-Cas9套裝產品,為基因編輯實驗提供方便、省時、可靠和高效的解決方案。

應用領域

銳博生物CRISPR-Cas9體系特別適用于從事胚胎干細胞多功能干細胞(iPSC)造血干細胞原代細胞祖細胞細胞治療(CAR-T)動物模型(受精卵)等研究的單位或客戶,非常適合應用于哺乳動物細胞單/多基因敲除、細胞改造、構建穩轉株、構建動物受精卵、胚胎干細胞或從受精卵開始大規模培養模式動物應用。

主要參考文獻

[1]Hendel A, et al.Chemically modified guide RNAs enhance CRISPR-Cas genome editing in human primary cells[J]. Nature Biotechnology,2015,33(9):985-989.

[2]Doetschman T, et al. Gene Editing With CRISPR /Cas9 RNA-Directed Nuclease[J].Circulation reseach,2017,120(5): 876-894.

[3] Serif M, et al.One-step generation of multiple gene knock-outs in the diatom Phaeodactylum tricornutum by DNA-free genome editin[J].Nature communication, 2018,9(1):3924.

[4]Vakulskas CA, et al.A high-fidelity Cas9 mutant delivered as a ribonucleoprotein complex enables efficient gene editing in human hematopoietic stem and progenitor cells[J]. Nature Medicine,2018,(8):1216-1224.

[5]Martin RM, et al.Highly Efficient and Marker-free Genome Editing of Human Pluripotent Stem Cells by CRISPR-Cas9 RNP and AAV6 Donor-Mediated Homologous Recombination[J].Cell Stem Cell,2019,24(5):821-828

[6]Martin RM, et al.Engineered CRISPR-Cas12a variants with increased activities and improved targeting ranges for gene, epigenetic and base editing[J].Nature Biotechnology,2019,24(5):821-828.

[7]Wu Y, et al.Highly efficient therapeutic gene editing of human hematopoietic stem cells[J].Nature Medicine,2019,25(5):776-783.

體系優勢

銳博專利情況:用于DNA編輯的系統及其應用,中國專利申請號:108977442A, PCT申請號:CN2018/088105

1.銳博專利技術:優化的crRNA,tracrRNA和Cas9 mRNA
2.瞬時表達,有效降低脫靶率
3.具有更高的編輯效率
4.毒性更低,激活先天免疫反應更小
5.即用型體系,更加易用,更適合從小規模實驗到大規模高通量篩選
6.無需繁瑣的克隆構建過程,節約更多人力和時間
7.無需病毒級實驗室,大大降低基因編輯對實驗環境的要求

riboEDIT?編輯效率保證套裝、標準套裝

銳博生物提供方便高效的基因編輯套裝產品:效率保證套裝標準套裝效率保證套裝針對人源基因,利用設計軟件挑選評分高的5條crRNA進行合成,基于Cas9 mRNA的體系而配置必備試劑,包括tracrRNA、Cas9 mRNA、mRNA轉染試劑、陽性對照crRNA套裝、T7E1酶及配套緩沖液等,提供即用型的基因編輯套餐。其中效率保證套裝可以實現MHCC97H細胞的T7E1酶切效率至少1條達到30%以上并提供相應的售后服務,標準套裝不提供任何編輯效率的保證。

riboEDIT? CRISPR-Cas9套裝產品

產品名稱 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set, 20T?
編輯效率保證套裝* 套裝編號:crG00001
標準套裝 套裝編號:crS00001

?*效率保證裝:按說明書操作條件下,對MHCC97H細胞的T7E1酶切效率可實現至少1條達到30%以上,若5條均低于30%,客戶須提供MHCC97H轉染效率與檢測方法步驟,經技術分析確認,免費重新優化設計,挑選合成5條crRNA并提供實驗技術指導。標準套裝不提供編輯效率有效性保證和免費重合服務,更多信息請見說明書。

套裝名稱 套裝產品內容
riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Set
(基于mRNA的全RNA體系/針對人源細胞)
riboEDIT? Designed crRNA(設計合成5條crRNA,每條5nmol)
riboEDIT? tracrRNA, 5nmol
riboEDIT? Positive Control crRNA Validation Set for Human *,? 3*5nmol
riboFECT? mRNA Transfection Reagent, 75ul
riboEDIT? Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug
riboEDIT? T7EI Enzyme (10U/ul), 100U

**Positive Control crRNA Validation Set for Human包括針對人源的陽性對照crRNA 5nmol、正向引物5nmol和反向引物5nmol

設計合成crRNA

riboEDIT? Designed crRNA采用銳博生物優化的生物信息學設計,客戶無需具備crRNA/sgRNA設計經驗,crRNA包含20個與目標DNA序列互補配對的核苷酸(原間隔序列)和與tracrRNA互補配對的重復序列,涵蓋人類和小鼠基因,每個基因設計合成3 – 6段單獨的sgRNA,經過嚴格的PAGE純化,其他物種crRNA設計需另行評估。

人源和小鼠設計合成crRNA每條的價格1250元/5nmol, 1650元/10nmol,大規格定制請在線詢價,提供crRNA序列設計服務。

crRNA陽性對照套裝

riboEDIT? crRNA陽性對照套裝用于檢測基因剪切體系的正確性,該套裝包括陽性對照crRNA、正向引物和反向引物,各5nmol。

化學合成tracrRNA

riboEDIT? tracrRNA采用化學合成tracrRNA,經PAGE純化,能夠抗核酸酶,能與crRNA結合形成crRNA/tracrRNA復合物,共同指導Cas9蛋白切割雙鏈DNA。

Cas9 mRNA

riboEDIT? Cas9 mRNA為體外轉錄生成,具有帽子和polyA尾巴結構,編碼序列為人源密碼子優化的S. pyogenes Cas9,帶有核定位信號(NLS),C端的一個1XFLAG標簽,5’非翻譯區(5’UTR)及3’非翻譯區(3’UTR),以促進mRNA的翻譯和提高mRNA的穩定性,適用于哺乳動物細胞基因編輯。

應用舉例:riboEDIT? CRISPR-Cas9 mRNA與RNP體系高效基因編輯效率

riboEDIT? Cas9 Expression mRNA具有高效的基因組剪切效率

圖1. MHCC97H細胞共轉染10pmol riboEDIT? crRNA、10pmol riboEDIT? tracrRNA和1ug riboEDIT? Cas9 mRNA,48小時后 riboEDIT? T7EI Enzyme酶切檢測靶位點的剪切效率,候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。如圖所示,#1#2表示同一基因不同位點設計的2條crRNA。

riboEDIT?Cas9 RNP具有高效的基因組剪切效率

圖2. MHCC97H細胞共轉染6pmol riboEDIT? crRNA、6pmol riboEDIT? tracrRNA和6pmol riboEDIT? Cas9 Protein,48小時后 riboEDIT? T7EI Enzyme酶切檢測靶位點的剪切效率,候選7個靶基因的剪切條帶及編輯效率。如圖所示,#1#2表示同一基因不同位點設計的2條crRNA。

圖3.? riboEDIT? CRISPR-Cas9 mRNA基因編輯體系與riboEDIT Cas9 RNP復合物具有等同的靶位點剪切活性。

常見問題解答

1. riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系相比于質粒載體表達Cas9和Cas9穩定表達細胞株或慢病毒系統有什么優勢?

答:(1)riboEDIT? CRIPSR-Cas9的全RNA體系或Cas9蛋白體系相比質粒載體或Cas9穩定表達細胞株而言,Cas9蛋白為瞬時表達,脫靶效率低、無DNA整合風險和啟動子兼容性問題,大大提高應用安全性。
(2)即用型體系,通過一步轉染,5-6個工作日即可完成編輯效率檢測,操作簡便,顯著縮短實驗周期。
(3)不需要自行構建載體或包裝慢病毒,不需要病毒級的實驗室環境。
(4)在大部分細胞中,比質粒表達載體具有更高的基因編輯效率。

2.如何快速確定crRNA的有效性?

crRNA/ tracrRNA 剪切效率與crRNA識別的靶序列有關,不同的crRNA剪切活性不同,推薦通過體外酶切實驗,在體外酶切靶DNA片段,快速篩選有效的crRNA,獲得高編輯效率的crRNA再進行后續的實驗。

3. riboEDIT? CRISPR-Cas9基因編輯系統識別的PAM序列是什么?

答: riboEDIT? Cas9 mRNA和riboEDIT? Cas9 Protein S. pyogenes Cas9為S. pyogenes Cas9,識別PAM序列NGG,N代表A,T,C,G。

4. riboEDIT? Pre-designed crRNA如何保證低的脫靶效率?

答:從crRNA的設計角度,使用更嚴格的序列比對分析。

5. T7EI酶切檢測編輯效率發現無剪切條帶是什么原因?

答:可能原因如下:
(1) 細胞轉染效率低,建議優化轉染步驟或換用容易轉染的細胞類型。
(2) Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋白降解,可通過設置陽性對照組排除Cas9 mRNA 或 Cas9 蛋
白降解的問題。
(3) 在細胞內,Cas9核酸酶無法接近靶位點或無法剪切靶位點,建議重新設計crRNA。
(4) 沒有進行DNA片段的變性、退火步驟。可通過設置陽性對照組確認實驗操作是否有誤。

6. 瓊脂糖凝膠電泳分析剪切效率時非特異性條帶多,無法分析剪切效率怎么辦?

答:可通過設置陰性對照組來區分目標剪切條帶和非目標條帶。必要時,需重新設計引物,或通過優化PCR條件,來降低非特異性擴增。建議采用巢式PCR,提高擴增片段的特異性。

7. T7E1 突變檢測時,出現條帶彌散的現象,應該如何解決?

答: 由于T7E1 本身具有弱的非特異切割DNA 鏈的能力,所以遇到這種情況,可以增加DNA 用量,降低酶的用量,減少酶切時間來降低非特異切割現象。

8.對于從事諸如干細胞、原代細胞或懸浮細胞,應該選擇哪一種riboEDIT? CRIPSR-Cas9體系?

答: 干細胞、原代細胞或懸浮細胞等難轉染細胞,轉染試劑一般很難達到理想的轉染效果,電轉方式更適合這類細胞的轉染,根據目前文獻支持,Cas9 RNP體系用于電轉具有更高的基因編輯效率,對于上述難轉染的細胞推薦用riboEDIT? CRISPR/Cas9 RNP體系,具體實驗條件需要自行優化。

9.是否可以將多條crRNA混合轉染?

答:可以,不論是混合轉染還是單條轉染,每條crRNA都按照本說明書同樣稀釋使用。

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產品編號 產品名稱 目錄價數量操作
C11061-1 riboFECT mRNA Transfection Control(EGFP),10ug ¥600.00
crG00001 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Guarantee Set, 20T(基因編輯效率保證套裝) ¥15,990.00 - 開始定制
crS00001 riboEDIT CRISPR-Cas9 mRNA Standard Set, 20T(基因編輯標準套裝) ¥11,990.00 - 開始定制
CR-NRA-1 riboEDIT Designed crRNA(設計合成crRNA) 詢價 - 開始定制
crRP0001VS riboEDIT Positive Control crRNA Validation Set for Human (驗證用陽性對照crRNA及正反引物) ¥1,000.00
crT00001-5 riboEDIT tracrRNA, 5nmol ¥628.00
crT00001-20 riboEDIT tracrRNA, 20nmol ¥1,380.00
C11055-1 riboEDIT mRNA Transfection Reagent, 75ul ¥800.00
C11057-1 riboEDIT Cas9 mRNA (0.5ug/ul), 20ug ¥2,950.00
C11053-1 riboEDIT Cas9 Protein, S.pyogenes(20uM), 500pmol ¥1,260.00
C11054-1 riboEDIT T7EI Enzyme (10U/ul),100U ¥880.00
人源和小鼠設計合成crRNA每條的價格:1250元/5nmol, 1650元/10nmol,大規格定制請在線詢價,提供crRNA序列設計服務。
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