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CCR7趨化因子受體刺激誘導樹突狀細胞(DC)向引流淋巴結快速而短暫的遷移,這對于啟動保護性免疫和維持免疫穩態至關重要。然而,終止CCR7介導DC遷移的機制尚不完全清楚。近期,曹雪濤研究組和劉娟研究組在Immunity(IF21.522)期刊發表了題為CCR7 Chemokine Receptor-Inducible lnc-Dpf3 Restrains Dendritic Cell Migration by Inhibiting HIF-1a-Mediated Glycolysis的研究成果。報道了一種長鏈非編碼RNA lnc-Dpf3通過抑制HIF-1α介導的糖酵解來反饋抑制CCR7介導的DC遷移。證明了CCR7誘導的lnc-Dpf3在耦合表觀遺傳和代謝途徑,以反饋調控DC遷移和炎癥反應方面的關鍵作用。進一步揭示了炎癥免疫反應后期及時終止DC遷移并減弱其免疫激活功能的分子機制。

主要研究路線

? ?lncRNA表達譜分析鑒定參與DC遷移的lncRNA分子(研究結果1)

? ?構建lnc-Dpf3缺失小鼠模型進行體內外功能研究及表型鑒定(研究結果2-3)

? ?確定調控lnc-Dpf3表達的機制(研究結果4)

? ?確定lnc-Dpf3抑制DC遷移的分子機制(研究結果5-7)

主要研究結果

1、lnc-Dpf3抑制CCR7介導的DC遷移

之前的研究已將STAT3結合的lnc-DC鑒定為DC成熟的關鍵調節因子。然而,lncRNAs在DC遷移中的功能仍然未知。有研究表明,呼吸道DCs從肺部向引流淋巴結(dLNs)快速而瞬時的遷移早在肺部病毒感染后6h就發生了,并在感染后18h迅速減緩;皮膚刺激也可在24h內誘導類似的DC從皮膚向dLNs遷移的瞬時性增加。因此,研究人員猜想CCR7刺激可能會在DC向dLNs遷移的峰值(體內感染或刺激后約18-24h)后誘導細胞內變化,從而起到反饋作用,防止DC過度積累。

為了驗證猜想,研究人員制備了LPS刺激的骨髓源性DCs(成熟DCs,mDCs),然后在體外用或不用CCR7配體CCL19和CCL21刺激mDCs 12小時。通過lncRNA表達譜分析,在CCR7刺激的mDCs中共檢測到34個差異表達的lncRNAs(18個上調,26個下調)。對18個上調的lncRNAs進行qRT-PCR分析證實,其中6個在CCR7刺激后顯著上調。隨后,通過對這6個lncRNAs進行RNAi介導的功能篩選,發現CCR7介導的mDC在體外的遷移可以通過沉默一個內含子lncRNA而顯著增加,該內含子lncRNA位于小鼠Dpf3基因的內含子1內,因此命名為lnc-Dpf3。

RACE實驗確定了lnc-Dpf3序列有4076個核苷酸。并且像大多數lncRNAs一樣,lnc-Dpf3有5’帽子結構和polyA尾,但沒有蛋白編碼能力。此外,證實了使用不同的silencers(該研究涉及的smart silencers由3條siRNA和3條ASO組成,可全方位高效抑制細胞核和細胞質定位的lncRNA或mRNA,均由銳博生物提供)沉默lnc-Dpf3可以有效地增加CCR7介導的mDC遷移。表明lnc-Dpf3在體外參與抑制DC遷移。

2、?DC特異性lnc-Dpf3缺失可選擇性促進CCR7介導的DC遷移

為了進一步探索lnc-Dpf3的生物學作用,研究人員通過同源重組產生了CD11c+DCs中lnc-Dpf3特異性缺失的lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠。并且證實了DC特異性DCS-Dpf3缺失不影響主要免疫細胞亞群的分化,也不影響DC的成熟和T細胞刺激能力。

那么,lnc-Dpf3缺失是否會影響CCR7觸發的DC遷移呢?研究人員發現與對照相比,CCR7刺激12h后,來自lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠的未成熟和成熟DCs的遷移增加。腺病毒介導的lnc-Dpf3過表達在12h后減少了CCR7觸發的DC遷移。但是在CCR7刺激后的早期階段lnc-Dpf3不影響DC的遷移。表明lnc-Dpf3在體外反饋抑制CCR7觸發的后期DC遷移中具有選擇性作用。

接下來,研究人員探索了lnc-Dpf3在體內的功能。發現與對照mDCs相比,lnc-Dpf3沉默的mDCs在注射后期(24-48h)顯示出向dLNs的遷移增加。同樣地,與注射后24-48h的mDCs相比,來自lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠的mDCs向dLNs的遷移也呈增加趨勢。用FITC涂抹皮膚后48 h,lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠dLNs中FITC+ DCs的比例增加。表明lnc-Dpf3在體內抑制后期DC向dLNs的遷移。

3、?DC特異性lnc-Dpf3缺陷小鼠出現更嚴重的炎癥

研究人員接下來探討了lnc-Dpf3在體內控制DC依賴性炎癥反應中的生理作用。以2,4-二硝基氟苯(DNFB)作為抗原的小鼠接觸性過敏(CHS)是一種成熟的人類接觸性皮炎模型,依賴于CCR7介導DC向dLNs的轉運。研究人員發現lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠在CHS誘導后出現更嚴重的炎癥反應,表現為耳腫脹程度加重、組織損傷加重、炎癥浸潤加重。這些小鼠的炎癥被發現在擴大的Th1和Th17細胞群,并且與對照相比,DNBS體外再刺激后dLNs中干擾素(IFN)-g和白細胞介素(IL)-17的濃度更高。此外,注射lnc-dpf3(負載DNBS)沉默的mDCs的小鼠在接受DNFB刺激后比對照小鼠產生更強的CHS反應。因此,lnc-Dpf3可減弱DCs的適應性反應和炎癥損傷。

由于穩定條件下CCR7介導的DC向dLNs的遷移有助于外周耐受,lnc-Dpf3是否也參與了穩態DC的遷移呢?研究發現lnc-Dpf3既不影響穩態DC遷移,也不影響外周耐受的產生。并且在穩態和炎性條件下,lnc-Dpf3在遷移DCs中均上調,但在炎癥條件下,又可選擇性減弱CCR7介導的DC遷移。

4、?CCR7刺激通過去除m6A修飾上調lnc-Dpf3的表達,以防止其降解

由于lnc-Dpf3的動態表達與其調控功能模式密切相關,那么lnc-Dpf3是如何被CCR7刺激調控的呢。研究人員首先通過ChIP實驗確定了CCR7刺激在轉錄水平上對lnc-Dpf3基因表達無影響,因此排除轉錄機制。接下來,研究了CCR7刺激是否影響lnc-Dpf3的亞細胞定位。FISH實驗發現lnc-Dpf3主要定位在胞質中,少部分位于細胞核。但CCR7刺激沒有明顯影響lnc-Dpf3的亞細胞分布。

隨后,研究人員猜想CCR7刺激是否通過RNA穩定性的轉錄后調控增加了lnc-Dpf3的表達。由于m6A廣泛影響RNA的代謝和穩定性,那么lnc-Dpf3在DCs中的動態表達是否受m6A相關調控呢?因此,研究人員通過MeRIP-qPCR在靜息mDCs中檢測到m6A顯著富集在lnc-Dpf3第22片段(3766-3903 nt), 并且CCR7刺激顯著降低了m6A的峰值。RIP實驗表明,lnc-Dpf3的m6A峰被m6A reader Ythdf2識別,CCR7刺激可下調Ythdf2對lnc-Dpf3的識別。而Ythdf1或Ythdf2本身的表達不受CCR7刺激的影響。此外,用siRNA沉默Ythdf2可上調lnc-Dpf3的表達。

接下來,研究人員對位于lnc-Dpf3第22片段3812-3815nt和3852-3855nt處的兩個m6A motifs進行突變并構建過表達質粒。發現與野生型相比,兩個m6A motifs突變的lnc-Dpf3過表達質粒可導致lnc-Dpf3的生命周期延長。表明lnc-Dpf3這兩個m6A修飾有助于lnc-Dpf3 RNA的衰變。MeRIP實驗進一步證實了lnc-Dpf3在3812-3815 nt和3852-3855 nt處的m6A修飾在介導lnc-Dpf3 RNA降解中發揮協同作用。

表明lnc-Dpf3在3812-3815nt和3852-3855nt處具有m6A修飾,可被Ythdf2識別并靶向其降解。CCR7刺激通過介導m6A去甲基化和減輕lnc-Dpf3的m6A依賴性RNA降解來上調lnc-Dpf3表達。

5、CCR7-誘導型lnc-Dpf3通過靶向HIF-1a抑制DC遷移

研究人員通過一系列的排除實驗發現通過PI3K、Akt和HIF-1α的信號傳導可能參與CCR7介導的DC遷移的功能。HIF-1α是細胞對低氧應激反應的中心轉錄因子,在控制先天免疫反應和適應性免疫反應的各個方面發揮著重要作用。考慮到感染組織和淋巴結的低氧微環境,研究人員推測lnc-Dpf3可能通過調節HIF-1α的激活來調控CCR7介導的DC遷移。并且發現DC特異性HIF-1α缺陷小鼠在體內外都表現出DC遷移受損。因此,HIF-1α是CCR7介導的DC遷移所必需的。

值得注意的是,mDCs中lnc-Dpf3的沉默或缺失增加了CCR7刺激誘導的HIF-1α的核轉位,而不影響細胞間總HIF-1α的豐度。RNA-seq分析證實,一系列HIF-1α靶向糖酵解基因(如Hk1,Ldha和Slc2a1)在lnc-Dpf3沉默的DCs中被上調。此外,EMSA和ChIP分析表明mDCs中lnc-Dpf3的沉默或缺失可增加mDCs中Ldha基因啟動子區HIF-1α的DNA結合活性和積累。表明lnc-Dpf3能夠減弱CCR7誘導的HIF-1α活性和糖酵解基因Ldha的表達。

然后,研究人員探索了lnc-Dpf3是否通過HIF-1α起作用。發現HIF-1α缺失可以阻斷lnc-Dpf3沉默或過表達在增加或減少DC遷移中的作用,通過siRNA沉默Hif1α可以抵消lnc-Dpf3沉默或缺失在增加DC遷移中的作用。表明lnc-Dpf3通過靶向HIF-1α抑制CCR7介導的DC遷移。

6、?lnc-Dpf3通過抑制HIF-1α依賴性糖酵解來抑制DC遷移

為了弄清楚CCR7依賴性遷移的代謝基礎,研究人員通過mDCs的代謝組學分析發現,在CCR7刺激后12小時,選擇性CCR7可誘導與葡萄糖代謝相關的代謝中間體(如葡萄糖1-磷酸、葡萄糖6-磷酸和果糖6-磷酸)的積累。代謝途徑富集分析(MPEA)表明,CCR7刺激可誘導與糖酵解密切相關的關鍵代謝途徑的變化,如淀粉和蔗糖的代謝。此外,還發現CCR7刺激后DCs的胞外酸化(ECAR)快速且持續增加。并且作為代謝轉向有氧糖酵解指標的ECAR/OCR(胞外酸化/耗氧量)比值在CCR7刺激12h后不斷增加,在lnc-Dpf3沉默的DCs中比值更高。

隨后,研究人員檢測到mDCs中的葡萄糖攝取、乳酸產量,NAD+/NADH比值增加,表明lnc-Dpf3的沉默或缺失可增加CCR7誘導的糖酵解;相反,過表達lnc-Dpf3或DC特異性HIF-1α缺失會抑制CCR7刺激mDCs中的乳酸產生。重要的是,用糖酵解抑制劑2-脫氧葡萄糖(2-DG)處理DCs可以在體內外抑制CCR7介導的DC遷移,并消除lnc-Dpf3沉默或缺失在增加DC遷移中的作用。因此,lnc-Dpf3是通過抑制糖酵解負調控后期DC遷移。

以上數據表明CCR7刺激可誘導DCs中HIF-1α依賴性糖酵解反應,并且lnc-Dpf3通過抑制HIF-1α依賴性代謝重編程轉向有氧糖酵解來抑制CCR7介導的DC遷移。

7、lnc-Dpf3通過HRE motif直接抑制HIF-1α從而抑制DC糖酵解

由于Hif1α自身mRNA表達不受lnc-Dpf3的影響,研究人員推測lnc-Dpf3可能與HIF-1α物理相關并通過翻譯后機制調控其活性。隨后通過RIP實驗、FISH實驗和鄰位連接技術證實了lnc-Dpf3和HIF-1α之間的物理相互作用,并且CCR7刺激增加了這種相互作用。接下來,研究人員用缺氧反應元件(HRE)驅動的熒光素酶報告基因來檢測HEK293T細胞中的HIF-1α活性,HEK293T細胞是一種具有與mDCs類似的CCR7蛋白表達的細胞系。發現在常氧和缺氧條件下,CCR7刺激均以Akt依賴性方式增強HIF-1α活性。過表達lnc-Dpf3抑制了HIF-1α的活化。隨后RNA pull-down實驗證實了全長lnc-Dpf3及其3000–4076 nt(F4)片段均可直接結合HIF-1α。

為了確定HIF-1α與lnc-Dpf3結合的區域,研究人員通過RIP實驗證實HIF-1α的NT1(N-末端結構域1,1-200 aa)和CT(C末端結構域,600-826 aa)結構域可以結合lnc-Dpf3,其他結構域則不行。此外,lnc-Dpf3主要在細胞質中與HIF-1α和CT結構域結合,與HIF-1α的NT1結構域的結合主要發生在細胞核中。

眾所周知,HIF-1α與靶基因啟動子區稱為缺氧反應元件(HREs)的核心核苷酸序列相結合。那么,HIF-1α是否可以與lncRNA上的HRE元件相互作用呢?研究人員發現在lnc-Dpf3 F4片段內的3686-3690nt處含有一個HRE motif,且該HRE-motif突變可部分削弱F4片段抑制HIF-1α活性的能力,并可消除lnc-Dpf3與HIF-1α的結合。腺病毒介導的lnc-Dpf3過表達,而不是其△HRE突變,可抑制CCR7介導的DC遷移和乳酸生成,并且可以挽救lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+小鼠mDCs中過度的DC遷移和乳酸生成。

接下來,研究人員構建了過表達WT HIF-1α慢病毒載體或在HIF-1α CT結構域中兩個保守氨基酸發生丙氨酸突變的慢病毒載體,分別為D810A的組成型失活突變和N814A組成型激活突變。發現與HIF-1α-WT相比,HIF-1α-N814A過表達可增強DC遷移,而過表達HIF-1α-D810A則抑制DC遷移。此外,HIF-1α-D810A過表達后可消除lnc-Dpf3fl/flItgax-cre+ DCs中遷移的增加。因此,HIF-1α活化對于lnc-Dpf3缺失引起的DC遷移增強至關重要。

總之,這些數據表明lnc-Dpf3通過其3000-4076nt結構域中的HRE motif與HIF-1α的N和C末端相互作用,并且該motif對于lnc-Dpf3抑制HIF-1α的活性和調節CCR7介導的DC遷移均具有重要作用。

原文:Liu J, Zhang X, Chen K, et al. CCR7 Chemokine Receptor-Inducible lnc-Dpf3 Restrains Dendritic Cell Migration by Inhibiting HIF-1α-Mediated Glycolysis[J]. Immunity, 2019, 50(3): 600-615. e15.

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